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瘦肉精检测

来源:网络转摘   访问人次:4814

  

        克伦特罗,为强效选择性β受体激动剂,有强而持久的松弛支气管平滑肌的作用,用于治疗哮喘。克伦特罗可促进动物生长,改善动物体内脂肪分配,并增加瘦肉率,20世纪90年代,我国错误地将其 作为科研成果开始以饲料添加剂引入并推广,被俗称为“瘦肉精”。一连串因食用含克伦特罗的食物而引起的中毒事件发生后,使克伦特罗成了上普遍禁用的饲料添加剂1997年以来,我国有关行政 部门多次明令禁止畜牧行业生产、销售和使用盐酸克伦特罗。但我国各地克伦特罗中毒事件仍然频繁 发生,说明非法使用克伦特罗现象依然亨在。为了对畜禽产品中的克伦特罗开展监测,加强市场监督检验力度,预防中毒事件的发生,必须建立效的检测方法。

  我国在这方面的检测工作起步较晚,伴随着国际和国内对克伦特罗的禁用和监控要求,迫切需要发 展适合我国国情的从筛选到确证的一套检测方法。为此,本标准提出了从酶联免疫法(ELISA)筛选、髙 效液相色谱法(HPLC)定量到气质联机法(GC-MS)确证和定E:这一袞方法来满足我国动物性食品中克伦特罗残留监控的需要.

  法气相色谱-质谱法(GC-MS)

  2原理

  固体试样剪碎,用高氣酸溶液勻浆。液体试样加人高氯酸溶液,迸行超声加热提取,用异丙醇+乙 酸乙酯(40 + 60)萃取,冇机相浓缩,经弱阳离子交换柱进行分离,用乙醉+浓氨水(98 + 2)溶液洗脱,洗 脱液浓缩,经N,0双三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)衍生后于气质联用仪上进行测定。以美托洛尔 为内标,定量。

  3试剂

  3-1 克伦特罗(clenbuterol hydrochloride),纯度>99* 5%。

  3.2 美托洛尔(metoprolol),纯度>99%。

  3.3磷酸二氢钠。

       3.4氢氧化钠。

  3.5氯化钠。

  3.6高氯酸。

  3.7浓氨水。

  3.8异丙醇。

  3.9 乙酸乙酯,

  3, 10 甲醇:HPLC 级。

  3.11甲苯:色谱纯。

  3.12乙醇。

  3, 13衍生剂:N,0-双三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)。

  3. 14高氣酸溶液(0.1 mol/U。

  3. 15氣氧化钠溶液(1 mol/L)。

  3. 16 磷酸二氢钠缓冲液(0.1mol/L,pH = 6.0)。

  3. 17异丙醇+乙酸乙酯(40 + 60)。

  3. 18 乙醇+浓氨水(98+2)。

  3. 19美托洛尔内标标准溶液:准确称取美托洛尔标准品,用甲醉溶解配成浓度为240 mg/L的内标储 备液,贮于冰箱中,使用时用甲醇稀释成2.4 mg/L的内标使用液0

  3.20克伦特罗标准溶液:准确称取克伦特罗标准品,用甲醇溶解配成浓度为250 mg/L的标准储备 液,贮于冰箱中,使用时用甲醇稀释成0.5 mg/L的克伦特罗标准使用液。

  3.21弱阳离子交换柱(LC-WCX)(3 mL)。

  3.22针筒式微孔过滤膜(0.45 μm,水相)。

  4仪器

  4.1 气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)

  4.2 磨口玻璃离心管:11. 5 cm(长)X3. 5 cm(内径),具塞。

  4.3 5 ml玻璃离心管.

  4.4 超声波清洗器a

  4.5  酸度计。

  4.6  离心机。

  4.7  振荡器。

  4. 8  旋转蒸发器。

  4.9   涡漩式混合器。

  4. 10   恒温加热器。

  4.11 N2-蒸发器。

  4. 12匀浆器4 

      5分析步骤

  5. 1提取

  5.1.1肌肉、肝脏、肾脏试样

  称取肌肉、肝脏或贤脏试样10 g(粘确到0.01 g),用20 mL 0. 1 mol/I.高氣酸溶液匀浆,;^于磨口 玻璃离心管中〖然后晋于超声波淸洗器中超声20 min,取出置于80°C水浴中加热30 min。取出冷却后 离心(4 500 r/min) 15 min。倾出上済液,沉淀用5 mL 0■ 1 m〇l/L高氣酸溶液洗絡,再离心,将两次的 上洁液合并。用〗mol/L氢氧化钠溶液调pH值至9. 5士0. 1,若冇沉淀产生,洱离心(4 500 r/min) 10 min,将上清液转移至磨口玻璃离心管中,加人8 g氣化钠,混匀,加入25 mL异丙醇+乙酸乙酯 (40 + 60),置于振荡器上振荡提取20 min。提取完毕,放置5 min(若冇乳化层稍离心一下)。用吸竚小 心将上层有机相移至旋转蒸发瓶中,用20 mL异丙醉+乙酸乙酯(40 + 60)再E犮萃取一次,合并冇机 相,于60C在旋转蒸发器上浓缩至近干。用1 mL 0. 1 mol/L磷酸二氢钠缓冲液(PH6. 0)充分溶解残 留物,经针筒式微孔过滤膜过滤,洗涤三次后完全转移至5 mL玻璃离心管中,并用0, 1 mol/L磷酸二 氢钠缓冲液(pH6, 0)定容至刻度。

  5. 1.2尿液试样

  用移液管跫取屎液5 mL,加人20 mL 0. 1 mol/L高氯酸溶液,超声20 min混勻。置于80°C水浴中 加热30 min。以下按5, 1. 1从“用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH似至9. 5±0, 1”起开始操作。

  5. 1.3血液试样

  将血液于4 500 r/min离心,用移液管量取上层血淸1 mLS于5 mL玻璃离心管中,加入2 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液,混匀,置于超声波淸洗器中超声20 min,取出界于80°C水浴中加热30 min。取出冷 却后离心(4: 500 r/min)15 min。倾出上淸液,沉淀用1 mLO. 1 mol/LJfJ氣酸溶液洗從,离心(4 500 r/min) 10 min,合并上清液,再重复一遍洗涤步骤,合并上济液。向上淸液中加人约1 g氣化钠,加人2 ml.舁丙醉 +乙酸乙酯(40+60),在涡漩式混合器上振荡萃取5 min,放置5 min(若冇乳化层稍离心一下),小心移出 有机相于5 mL玻璃离心管中,按以上萃取步骤重复萃取两次,合并冇机相。将冇机相在N2-浓缩器上吹 干。用1 mL (XI mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0)充分溶解残留物,经简式微孔过滤膜过滤完全转移至 5 mL玻璃离心管中,并用0.1 mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0)定容至刻度。

  5.2净化

  依次用10mL乙醇、3 mL水、3mL0. 1 mo丨/L磷酸二氢钠缓冲液(pH6.0),3 mL水冲洗弱PT1离子 交换柱,取适量5. L 1、5. 1.2和5*1. 3的提取液至弱阳离子交换柱上,弃去流出液,分別用4 mL水和

  4 mL乙醇冲洗柱子,弃去流出液,用6 mL乙醇+浓氨水(98 + 2)冲洗柱子,收集流出液。将流出液在 N2-蒸发器上浓缩至干。

  5_3衍生化

  于净化、吹干的试样残渣中加人100 ML〜500 中醉,50 yL 2. 4 mg/L的内标工作液,在N2-蒸发

  器上浓缩至干,迅速加人4〇mL衍生剂(BSTFA),盖紧塞子,在涡漩式混合器上混勻1 mirug于75T:的 恒温加热器中衍生90 min。衍生反应完成后取出冷却至室温,在涡漩式混合器上混勻30 3,罝于N2-蒸发器上浓缩至干。加人200 ;xL甲苯,在涡漩式混合器上充分混匀,待气质联用仪进样。同时用克伦特 罗标准使用液做系列同步衍生。

  5,4气相色谱-质谱法测定

  5.4. 1气相色谱-质谱法测定参数设定

  气相色谱柱:DIV5MS 柱,30 m X 0• 25 mmXO. 25 pma 载气:He,柱前psU 进样口温度:240flC。

  进样量HU不分流.

  柱温程序:70t:保持1 min,以18t:/min速度升至200X:,以StVniin的速度再升至245T:,再以 25T:/min 升至 280X:并保持 2 min。

  EI源

  电子轰击能:70 eV。 •

  离子源温度:200t:。

  接口温度:2851。

  溶剂延迟:12 min。

  £1源检测特征质谱峰:克伦特罗:11^86、187、243、262;美托洛尔:11^72、223。

  5.4,2测定

  吸取1 衍生的试样液或标准液注人气质联用仪中,以试样峰(m/2 86,187,243,262,264,277,

  333)与内标峰(m/z 72,223)的相对保留时间定性,要求试样峰中至少冇3对选择离子相对强度(与基峰 的比例)不超过标准相应选择离子相对强度平均坑的士20%或3倍标准差。以试样峰(m/2 86)与内标 岭(mA 72)的峰面积比单点或多点校准定量。

  5,4.3克伦特罗标准与内标衍生后的选择性离子的总离子流图及质谱图




 5.5结果计算

  按内标法单点或多点校准计炸试样中克伦特罗的含量。

  见式(1):

  6精密度

  在重复性条件下获得的两次独立测定结果的差值不得超过笄术平均值的20%。


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