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多肽分子量的测定

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多肽分子量的测定  

多肽分子量的测定

  

  用此方法测定多肽或蛋白质的分子量

  1、 实验原理

  SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)是对蛋白质进行景化,比较及 特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法主耍依据蛋白质的分子贵对其进打分离。SDS与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折昝结构,并使其稳定 的存在于一个广泛均一的溶液中。SDS-蛋白质复合物的长度与其分子虽成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质 亚基的电泳迀移率主要取决于亚基分子量的大小,而电荷闪素可以被忽略。SDS -PAGE闪易于操作和广泛应用,使它成为许多研究领域中的一种重要的分析技术。

  SDS是十二烷基硫酸钠的简称,它是一种阴离子表面活性剂;加入到电泳系 统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开,并结合到蛋白质分子上,使各种蛋白质一 SDS复合物都带上相同密度的负电荷,其数黾远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,从而掩盖了不冋种类蛋白之间原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素,于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所做的标准曲线,渴求的未知物的分子量。

  2、实际和仪器设备

  (1)材料 花生粕

  (2)试剂

  N,N,N,N-四甲基乙二酰;过磷酸铵;SDS;溴酚蓝;蔗糖;三羟甲基氨基甲烷;1mol/LHCl溶液;丙烯酰胺;N,N-甲叉双丙烯酰胺;甘油、甘氨酸;琼脂糖;甲醇、冰乙酸;考马斯蓝R-250

  (3)仪器

  DYY-W-6B型稳压稳流电泳仪;夹心式垂直板型电泳槽;Anke DL-4008低温高速离心机;DU-800核酸蛋白质分析仪;PHS-3C精密PH计;微量注射器(10或50u);分析天平;DSHZ-300A旋转式恒温振荡器;Kjcl-tec2400/2460型全自动凯式定氮仪;冷冻干燥机等。

  3.试验步骤

  (1)胶的制备具体操作方法

  ①分离胶的制备

  按表四配置好的分离胶溶液混匀后,沿着凝胶的长玻璃片的内面用细长头的滴管加至长、短玻璃片的摘缝内,加胶高度距样品槽模板下缘约1cm,用1ml注射器取少量蒸馏水,沿长玻璃板壁缓缓注入,约3-4cm高。约30分后,凝胶与水封层之间出现折射率不同的界限,此时凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水,再用滤纸条洗去多余水分,并用毛边滤纸条吸取残余水液。

  ②浓缩胶的制备

  按表四配置的浓胶溶液混匀后用细长头的滴管加至已聚合的分离胶上方,直至短玻璃板上缘约0.5cm,轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内,约30分钟后凝胶聚合,再放置20-30分钟,使凝胶“老化”。小心拔去样品槽模板。用窄条滤纸吸取样品凹槽多余的水分。


  制胶过程中容易出现气池,可用蒸馏水瓶向长、短玻璃片中注入水以便使气泡溢出,如果气泡不易溢出则用车细长头挑出。

  (2)待测样品及标准样品的处理

  ① 待测样品的处理

  称取待测样品0.1g 于1.5ml离心管中加入lml蒸馏水中,将其放入85°C怛温水浴中15min,以此促进同体物质的溶解,此后从怛温水浴中取出离心管冷却 至室温,再将其稀释5倍。

  ② 标准样品的处理

  取5ml标准样品溶液,加样品缓冲液15ml,然后再加入25ml蒸馏水,混匀后即可作为加样标准液。

  (3) 电泳

  将pH=8.3的电极缓冲液倒入上下r槽中,并使液而没过短玻璃片。用微量注射器依次在样品凹槽内加样。将电压上限控制在200V以内,上槽接正极,下槽接下级,打开电源,开始时将恒定电流控制在30mA,带样品进入分离后, 将电流调为50mA。带蓝色染料迁移至下端1〜1.5cm时停止。

  (4) 胶片的处理

  取下凝胶模子,在蒸馏水冲洗的条件下,用小物件轻轻将敲开玻璃板,将凝胶片取出,使之滑入一白瓷盘或大培养皿内,并沿加样槽底部直线将部分切除, 加入固定液同定30min后,倾出同定液,然后加入染色液,在40°C、65r/min的 条件下染色染色完毕后,则倾出染色液,加入脱色液在40°C, 65r/min 的条件下脱色,每三小时换一次脱色液,直至背景淸晰,共用一昼夜时间,然后 将凝胶移至只有乳白色屏幕的发光板上,用细颗粒全色胶卷摄影,得呈现蛋白质谱带的照片.

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