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核酸检测

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  核酸的定量与纯度的测定在分子生物学实验中,核酸提取需要进行其纯度和浓度的测定。目前实验室常用的测定方法主要有分光光度法、荧光染料法、PCR法和杂交定量法等。

核酸检测

  分光光度法

  分光光度法主要包括紫外分光光度法、定糖定磷法及基于酶催化的核酸定量方法等。

  (1)紫外分光光度法

  紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,DNA/RNA在260nm处有大的吸收峰,蛋白质在280nm处有大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处。因此,可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA,单链DNA浓度约为33µg / ml,RNA约为40μg/ml,寡核苷酸约为35μg/ml。

  如用1cm光径,用H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:

  DNA(mg/ml)=50×OD260读数×稀释倍数/1000 RNA(mg/ml)=40×OD260读数×稀释倍数/1000。A280nm是蛋白和酚类物质高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA的A260/A280比值为1.8,纯RNA为2.0。假如比值低,表示受到蛋白(芳香族)或分类物质的污染,需要纯化样品。比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。A230nm是碳水化合物高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度,该值应该接近0.0。

  假如不足,标明溶液中有悬浮物,需要纯化样品。

  实验步骤

  1、将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中pH8.0,10mmo1/L的Tris缓冲液,内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。

  2、用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线,测定OD260和OD280,并计算比值:OD260/OD280,纯DNA的此比值约为1.8~2.0。纯RNA的此比值为大于2.0。

  3、根据每毫升1微克的纯DNA的OD260值=0.020,计算所得DNA的纯度;每毫升1微克的纯RNA的OD260值= 0.025,计算所得RNA的纯度。注意事项OD值范围应该在0.1~0.99之间,否则不符合上述线性关系。A260/A280比值可提供DNA纯度的一个参考,但A260/A280 比值会受pH影响。

  如果未调pH,比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值,建议在10 mM Tris Cl,pH 8.5中检测,此时纯净的DNA A260/A280比值应为1.8-2.0(注意应使用同样缓冲液作为对照)。

常见问题分析

      1、DNA浓度测定的OD260/OD280比值大于1.8,说明存在RNA,可重新用RNaseA处理,酚:氯仿:异戊醇(23:24:1)抽提;DNA浓度测定的OD260/OD280比值小于1.8,则说明有蛋白质等杂质存在,需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、异戊醇重新对DNA进行纯化(也可加入1/8体积的3M NaAc(pH5.2)与冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。

  RNA浓度测定OD260/OD280比值小于1.8时,说明溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显;OD260/OD280比值大于2.2时,说明RNA已经水解成单核酸了。

  2、采用紫外检测法测核酸含量的优缺点:用紫外光吸收法测定样品的核酸含量,具有简单、快速、灵敏度高的优点,并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质,产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时,则会产生较大测定误差,需要设法事先除去。

  3、样品中含有核苷酸类杂质:假如样品中蛋白质、核苷酸类物质较多可以通过离子层析柱进一步提纯,再用紫外吸收法测定。

  4、样品体系中其它物质对实验结果有干扰:蛋白质由于含有芳香氨基酸,因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm处,在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低,故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上,DNA的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时,比值即下降。


  (2)定糖定磷法

       定糖定磷法是通过测定核酸中戊糖和无机磷含量实现对核酸含量的测定。该法无需特殊仪器,只需要将地衣酚、二苯胺及钼酸铵等与核酸样品反应,再通过分光光度计测定光吸收值即可定量核酸。但此法准确度差、灵敏度低、干扰物多、操作繁琐,在现今的研究中已较少采用。比如二苯胺法是利用脱氧核糖核酸中的α—脱氧核糖在酸性环境中变成ω—羟基—γ酮基戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物,在595nm处有大的吸收,在每毫升含DNA20-400微克范围内,光密度与DNA的浓度成正比,在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应的灵敏度。除DNA外,脱氧木糖、阿拉伯糖也有同样的反应。

  1、DNA标准曲线的制作取8支试管,编号,以一定的梯度依次加入不同浓度的DNA溶液和二苯胺试剂试剂。加毕,摇匀,于60℃恒温水浴中保温1小时,(或于沸水中煮沸15分钟,冷却测0.D595nm值)。以光密度为纵坐标,DNA含量(ug/ml)为横坐标,绘制标准曲线。

  2、样品的测定取2支试管,各加0.2-0.5毫升的待测液(内含DNA应在标准曲线可测范围之内)加蒸馏水稀释至2毫升,再加4毫升二苯胺试剂,摇匀,其操作步骤与标准曲线的制作相同。根据测得的光密度值,从标准曲线上查出相当该光密度DNA的含量,按下式计算出样品中DNA的百分含量。

  DNA含量/毫升待测液=标准曲线查得值×稀释倍数


  注意事项

  1、二茉胺法测定DNA含量灵敏度不高,待测样品中DNA含量低于50mg/L即难以测定。乙醛可增加二苯胺法测定DNA的发色量,又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰,能显著提高测定的灵敏度。

  2、样品中含有少量RNA并不影响测定,但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物,故能干扰DNA定理。

  (3)酶催化法

  基于酶催化的核酸定值方法是一种相对核酸定量法。其原理是染料能同时与酶和核酸结合,通过检测酶的催化活性即可实现对核酸的定量。此法的优点在于不需要通过核酸扩增,操作方便,使用的仪器简单。但该法实验中,酶的催化活性受多方面影响,难以达到佳状态,会使定量结果出现偏差。

  荧光染料法

  荧光染料法是通过检测荧光试剂与DNA结合后的荧光强度变化而实现对核酸的定量。某些荧光探针试剂本身荧光强度不大,但与DNA 结合后荧光强度大大增强,如:溴化乙锭在水溶液中的荧光量子产率很低,但它与DNA结合后,产生很强的荧光,激发波长显著红移;又如Hoechst33258是一种双苯并咪唑荧光染料,可高度特异地与双链DNA非嵌入性结合,结合后其荧光率由0.01增至0.6。

  荧光染料法适用于样品中DNA或RNA 含量较低或含有较多杂质的样品,灵敏度很高.如利用Hoechst33258可测定纳克级水平的DNA。PicoGreen及SYBR GreenI的检测灵敏度较EB和Hoechst33258更高,PicoGreen可检测低至0.25-0.5ng的DNA样品。

  目前已有许多商品化核酸定量荧光染料,如Invitrogen公司用于测定双链DNA的PicoGreen、用于测定单链DNA的OliGreen及用于测定RNA含量的RiboGreen等。含这些染料的核酸定量试剂盒被认为是目前对微量核酸定量较准确的方法。

  与紫外分光光度法相比,荧光染料法的应用尚不广泛.它存在以下缺陷:

  (1)某些荧光染料(如EB等)具有极强的毒性和致诱变性;

  (2)荧光分析对环境因素极为敏感,易受温度、光度、酸度、溶解氧及污染物等干扰;

  (3)该法需制作标准曲线,操作较复杂;

  (4)需专业的定量试剂盒,价格昂贵;

  (5)精确定量需依赖已知浓度的标准物质,而目前缺乏经过精确定值的标准物质,且少数现今采用标准物质(λDNA)的定量方法为紫外分光光度法,这就产生潜在的偏差并使测量结果无法溯源到国际单位制。

  PCR法

  (1)PCR电泳法

PCR技术检测简便快速、灵敏度高、特异性强、且扩增模式多样,常见的有套式PCR、竞争PCR及终点稀释法等。套式PCR通过嵌套引物的使用进一步增加了标准PCR的特异性和灵敏度。

  终点稀释法通过梯度稀释待检样本及分别PCR,直到扩增结果为阴性,依据稀释倍数计算起始靶基因的分子数。这种分析方法的优点是核酸的定量不依赖扩增效率,操作简便,灵敏度高。但每个样品需多次PCR反应,工作量大,且需获得稳定的PCR反应条件。

  无论是标准PCR还是改进的套式PCR、竞争PCR及终点稀释法,反应产物均需进行电泳,而电泳图谱只能通过对比明亮度达到相对定量,其检测灵敏度、特异性及定量准确性均较差,且易受多糖、蛋白等杂质及反应体系的影响。

  (2)PCR产物微孔板杂交法

       PCR产物微孔板杂交法结合了PCR技术、核酸杂交技术及酶联免疫技术,该法具有以下突出优点:检测灵敏度高于琼脂糖凝胶电泳;显色反应类似酶联免疫检测,特异性强;仪器容易操作,稳定性好,数据读取客观;杂交过程短,可以同时大量检测;可实现PCR产物的定量或相对定量等。但该法操作步骤较繁琐,且放射性物质对人体有害。

  (3)实时荧光定量PCR

  qPCR技术由Higuchi于1992年提出,其原理是在标准PCR反应体系的基础上加入荧光染料或荧光基团,利用荧光信号的累积实时监测整个PCR过程,后通过标准品所建立的标准曲线对未知模板进行定量或通过与内标准基因的对比进行相对定量。qPCR技术因其既可定性又可定量、灵敏度高、动态范围广等优点而得到了广泛的认可和应用,已成为核酸定量的主流技术,其常用的荧光标记物质有TaqMan探针、MGB、SYBR、分子信标等。大量的科研工作使用qPCR,每年产生大量的文章,但是在样品质量控制、实验设计、实验指标及实验结果描述等方面尚缺乏共识,使得各种存疑数据得以发表。

  (4)数字PCR

  dPCR是近年发展起来的一种可实现定量的PCR技术。与传统PCR相比,数字PCR以大规模集成流路芯片为基础,可将样品分到许许多多个单独的区域进行PCR反应,反应结果报告“有”或“无”。后通过PCR循环数推算起始模板含量。因此,样品即便含有会产生干扰信号的杂质分子,但由于杂质分子不会发生PCR放大,其信号将不会影响终检测结果。数字PCR不仅检测灵敏度高(可检测单个DNA分子)、所需样本量少,且准确度好(误差可控制在0.25%以内)、无需标准物质对照,是一种潜在的基因定量标准方法.研究人员已将其应用于疾病及转基因的检测。但该法的主要缺陷是所使用的仪器和耗材十分昂贵,难以在各实验室普及。

  总之,灵敏度和特异性均表现的PCR技术检测是现今生物样品中微量核酸检测的现成、有效的方法。但是,PCR扩增普遍遇到的弊端是管与管之间的扩增重复性较差,即使是在严格的控制条件下其重复性仍难以保证。重复性差的可能原因有仪器性能、反应条件、抑制剂的存在、样品制备差异、核酸纯化和模板的降解等。另外,还存在以下缺点:qPCR及dPCR等耗材价格昂贵,很难普及;由于定量全过程封闭,不能监测扩增产物的大小;当引物特异性不高时,可能形成假阳性;RNA反转录时各样品的误差太大等。

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